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本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌（革兰氏阳性菌和阴性菌）的基因组DNA。溶菌酶能有效去除细菌细胞壁；蛋白酶K能把核酸解离出来；RNaseA能去除痕量的RNA污染；离心吸附柱能够高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

• 准备55℃和70℃水浴；无水乙醇；1.5mL灭菌离心管。
  
• 按照标签所示在去蛋白液GD和漂洗液GW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。
  
• 每次使用前请检查缓冲液GA，缓冲液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

• 取细菌培养液1～2mL，10000g离心1分钟，尽量吸净上清；向细菌沉淀中加入180μL EB，旋涡混匀后加入18μL溶菌酶，室温放置10～15分钟，期间间歇混匀几次。
  
  • 溶菌酶的用量和处理时间与处理的细菌种类密切相关，用户可以根据细菌种类进行调节。如革兰氏阳性菌应将处理时间延长到30～60分钟。
• 10000g离心1分钟，吸弃大部分上清，留下约10μL液体，彻底混匀。
  
  • 由于余留的液体较少，彻底混匀菌体不太容易，用手指弹动管壁附加枪头反复吹打既能完全混匀菌体。混匀一定要彻底，否则容易导致步骤8中离心柱堵塞。
• 向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，混匀。
  
• 向管中加入20μL蛋白酶K，混匀，55℃处理15～30分钟，期间间歇混匀2～3次至溶液清亮。
  
  • 加入蛋白酶K后会产生絮状物，消化彻底的标志是絮状物完全消失，溶液变清亮。如消化不彻底，会导致步骤8中离心柱堵塞。
• 加入10μL RNaseA(10mg/mL)溶液，混匀后室温放置2分钟。
  
• 加入220μL缓冲液GB，混匀，70℃放置10～30分钟(对于革兰氏阳性菌，时间应延长到60分钟)。
  
  • 加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置相应时间后溶液会变清亮。如溶液未变清亮，应延长70℃处理时间。如果絮状物不能处理干净，容易导致步骤8中离心柱的堵塞。
• 加入220μL无水乙醇，充分混匀。
  
  • 加入乙醇后会产生絮状沉淀，可用枪头反复抽打1～2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理，容易导致步骤8中离心柱的堵塞。
• 将上一步所得溶液和絮状沉淀加入到吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中)，11000g离心5分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。
  
  • 如果出现吸附柱堵塞现象，可将离心时间延长到10分钟。
• 向吸附柱CG中加入500μL去蛋白液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000g离心2分钟，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱CG中加入700μL漂洗液GW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000g离心60秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱CG中加入500μL漂洗液GW，11000g离心60秒，倒掉废液。
  
• 吸附柱CG放回收集管中，11000g离心2分钟。
  
  • 此步骤非常重要，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
• 将吸附柱CG转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～100μL经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，11000g离心2分钟。
  • 洗脱缓冲液体积最好不少于50μL，体积过小影响回收效率。
    
  • 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。
• DNA产物-20℃保存。